吡啶甲酸鉻安全性研究進(jìn)展
最近由于毒膠囊事件，大家談鉻色變。實(shí)際上有毒的是六價(jià)鉻，三價(jià)鉻還可以用作食品和飼料添加劑。下面的文章介紹了吡啶甲酸鉻的安全性。
作者簡(jiǎn)介：畢晉明，北京華谷生物營(yíng)養科技發(fā)展有限公司，碩士。
張敏紅，中國農業(yè)科學(xué)院研究員，博士生導師，主要從事動(dòng)物營(yíng)養方面研究礦物元素是動(dòng)物營(yíng)養中的一大類(lèi)無(wú)機營(yíng)養素。目前已查明的必需微量元素有鐵、鋅、銅、錳、碘、硒、鈷、鉬、氟、鉻、硼等12種，且必須由外界供給。各元素在供給量上存在一安全范圍，添加量不足導致相應元素缺乏癥，添加量超過(guò)安全范圍便導致機體中毒。同時(shí)發(fā)現，畜禽對微量元素的耐受性也隨動(dòng)物種類(lèi)而異。豬、禽對鐵的耐受量為3000mg/kg、1000mg/kg，對銅的耐受量為250mg/kg、300mg/kg，其他微量元素同樣具有類(lèi)似效應。當微量元素在飼糧中含量較低時(shí)為必需礦物元素，在含量過(guò)高情況下則可能是有毒有害元素，必需礦物元素和有毒有害元素對動(dòng)物而言是相對的。
鉻元素作為必需微量元素之一，其生理作用日益受到研究者重視。研究表明：鉻與糖代謝、脂代謝、蛋白質(zhì)代謝以及核酸代謝密切相關(guān)。同時(shí)發(fā)現，各種動(dòng)物對鉻的耐受力都較強?？赡褪茔t的氧化物3000mg/kg，鉻的氯化物可耐受1000mg/kg。吡啶甲酸鉻作為有機鉻制劑，其安全性也日益受到關(guān)注。在畜牧生產(chǎn)上，吡啶甲酸鉻對緩解環(huán)境應激、提高瘦肉率、增強抵抗力均有明顯的促進(jìn)作用，而被廣泛應用。但究其使用量而言，雖然一些國家已批準吡啶甲酸鉻在畜禽日糧中的添加，但目前尚未正式發(fā)布動(dòng)物最低需要量和最高耐受量數據。研究報道，血漿鉻的正常生理濃度為0.1-2.1μg/ml(Cerullietal.,1998)，人類(lèi)肝中鉻的生理濃度為5.4-470ηg/g肝濕重（－0.1-9μM）（Versieck，1985），超量添加（遠高于生理劑量）吡啶甲酸鉻有可能產(chǎn)生DNA毒性和細胞毒性。為此，本文對吡啶甲酸鉻的安全性進(jìn)行綜述，以便為日后吡啶甲酸鉻的研究提供理論基礎。
1、吡啶甲酸鉻理化特性及結構特征
吡啶甲酸鉻（Chromiumpicolinate），分子式Cr(C6H4NO2)3，分子量為418.33，紫紅色結晶性細小粉末，常溫下穩定，微溶于水，不溶于乙醇。整個(gè)分子結構呈電中性，且具有疏水特性，因此可以以完整的結構進(jìn)行跨膜吸收。吡啶甲酸鉻的分子結構與GTF部分相似。1977年，Toepfer認為GTF是鉻的生物活性形式，其結構為煙酸-鉻-煙酸與天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸形成的配合體。吡啶甲酸鉻的類(lèi)GTF結構決定了自身較好的吸收率，并能更有效地發(fā)揮自身的生物學(xué)功能。據報道，普通鉻制劑吸收率為0.5%左右，而吡啶甲酸鉻吸收率達2%－5%（Anderson，1996）。
2、吡啶甲酸鉻安全性研究
吡啶甲酸鉻作為營(yíng)養添加劑，已經(jīng)得到廣泛的應用。但是從1995年首次報道了吡啶甲酸鉻的危害性之后，吡啶甲酸鉻的安全性問(wèn)題就一直成為研究的熱點(diǎn)。迄今為止，對吡啶甲酸鉻的安全性研究已得到一些數據，但結論不盡相同。
據NTP（NationalToxicologyProgram）報道，不管有無(wú)添加小鼠肝臟S9代謝激活物，吡啶甲酸鉻對TA1535、TA97、TA98、TA100、TA102、TA104細胞株均未致突變性。在小鼠日糧中添加2500mg/kg.bw的一水吡啶甲酸鉻，小鼠骨髓細胞未發(fā)現基因斷裂效應。Kato等（1998）對十位肥胖女士（每日服用400mg吡啶甲酸鉻）觀(guān)察，八周后尿樣中DNA堿基氧化產(chǎn)物5-羥甲基尿嘧啶水平?jīng)]有發(fā)生變化。Anderson等(1997)向小鼠日糧中添加100mg/kg日糧的鉻（吡啶甲酸鉻形式），飼喂24周也未發(fā)現吡啶甲酸鉻急性毒性。
針對超量添加吡啶甲酸鉻時(shí)的細胞毒性和基因毒性也有研究報道。吡啶甲酸鉻細胞毒性主要體現在細胞凋亡和線(xiàn)粒體損傷上。Manygoats(2002)研究發(fā)現，1mM（125倍適宜量）吡啶甲酸鉻添加可導致線(xiàn)粒體損傷和細胞凋亡，可能是由于線(xiàn)粒體呼吸作用受到抑制（主要發(fā)生在復合體Ⅰ上），NADH的合成減少，消耗增大所致；線(xiàn)粒體內膜通道的破壞（線(xiàn)粒體的滲透性轉換孔—MPT途徑），導致線(xiàn)粒體基質(zhì)成分喪失，線(xiàn)粒體功能和細胞器發(fā)生實(shí)質(zhì)性膨脹，接著(zhù)線(xiàn)粒體外膜破裂，細胞色素C和凋亡誘導因子釋放，進(jìn)而激活核酸內切酶和Caspase，引發(fā)細胞凋亡(GreenD等,1998)。
吡啶甲酸鉻基因毒性主要表現在DNA堿基氧化、DNA鏈斷裂和基因突變上。Hepburn(2003)研究發(fā)現：給小鼠注射吡啶甲酸鉻80天后（~600uMCr,75倍適宜量），造成脂質(zhì)過(guò)氧化，并使尿中DNA堿基氧化產(chǎn)物8-oxo-dG含量升高。另有報道提示：在諸如維生素C之類(lèi)的生物抗氧化劑存在的條件下，吡啶甲酸鉻可以斷裂DNA雙鏈，使超螺旋DNA松弛。Stohs(1998)等研究發(fā)現，50mg/ml（120mM）吡啶甲酸鉻處理巨噬細胞J774A.124h后，造成DNA鏈斷裂，細胞中存在DNA碎片。SpeetjensJK(1999)的體外實(shí)驗研究發(fā)現：吡啶甲酸鉻可以導致質(zhì)粒DNA單鏈斷裂。在小鼠淋巴細胞上的毒理試驗表明：不管是否添加S9，1.2mM（150倍適宜量）、2.39mM吡啶甲酸鉻均顯著(zhù)誘導淋巴細胞基因突變（Whittaker等，2005）。
由此可見(jiàn)，在體內研究吡啶甲酸鉻的安全性上，除靜脈注射途徑外，未見(jiàn)毒性報道。這可能與吡啶甲酸鉻的吸收率（2%－5%）以及機體內環(huán)境代謝有關(guān)；吡啶甲酸鉻靜脈注射途徑的吸收率遠高于腸道吸收率。體外細胞培養研究上，多數實(shí)驗報道，超量添加吡啶甲酸鉻（>0.6mM，75倍適宜量）對細胞和DNA產(chǎn)生毒性作用。但也有個(gè)別試驗報道，高劑量吡啶甲酸鉻（>0.6mM）對細胞和DNA不產(chǎn)生毒性作用，這可能與不同細胞株的耐受性不同和吡啶甲酸鉻的吸收率降低有關(guān)。
3、超量添加吡啶甲酸鉻毒性作用的代謝途徑
迄今為止，從國內外吡啶甲酸鉻安全性研究報道中發(fā)現，吡啶甲酸鉻毒性作用與其代謝途徑密切相關(guān)，其代謝途徑主要歸納為兩條。
3.1吡啶甲酸鉻氧化-還原途徑
吡啶甲酸鉻在胞內還原劑（維生素C，硫醇等）存在的條件下發(fā)生類(lèi)Fenton反應。在此過(guò)程中生成大量對DNA穩定性影響的ROS，如超氧離子，過(guò)氧離子，羥基自由基，過(guò)氧化氫等。ROS的產(chǎn)生，使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過(guò)氧化生成羰基蛋白、脂質(zhì)過(guò)氧化物等氧化產(chǎn)物，同時(shí)使細胞膜通透性、膜流動(dòng)性降低，細胞脆性升高，細胞完整性遭到破壞。另一方面，ROS產(chǎn)生后降低了Ca2+-ATP酶與鈣通道活性，造成Ca超載，從而激活Ca2+-依賴(lài)蛋白酶，磷脂酶（PLA2）及核酸內切酶（劉欣等，2001）。PLA2的激活,使膜磷脂降解,磷脂含量降低,導致膜通透性增加,Ca2+易于進(jìn)入細胞內,使細胞內Ca2+超載，形成惡性循環(huán)。核酸內切酶的激活,催化基因組DNA在核小體間降解;Ca2+濃度的升高還可激活谷氨酰胺轉化酶和蛋白激酶C等,使細胞骨架斷裂,細胞漿蛋白交叉聯(lián)合,促使凋亡發(fā)生（Ui-Tei等，2000）。此外，Ca2+濃度的改變還可激活凋亡相關(guān)蛋白激酶與Caspase家族的級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。Fenton反應增強后，ROS基團可氧化DNA堿基。通過(guò)脫氧核糖的C8位點(diǎn)上的脫氫作用氧化DNA，使鳥(niǎo)嘌呤氧化成為8-oxo-dG；胸腺嘧啶氧化生成5-羥甲基尿嘧啶。
3.2吡啶甲酸鉻酶促分解途徑
在胰島素依賴(lài)性細胞中，Apo-LMWCr從吡啶甲酸鉻復合體中對鉻進(jìn)行吸附，使吡啶甲酸脫離復合物，游離于胞內，從而造成細胞毒性。在體內吡啶甲酸是色氨酸的代謝產(chǎn)物，它的產(chǎn)生可以誘導一氧化氮合酶表達，導致氮自由基產(chǎn)生，進(jìn)而引發(fā)細胞凋亡。吡啶甲酸還可改變細胞膜的流動(dòng)性，并能阻止細胞周期（S期）循環(huán)。毒理學(xué)試驗表明：吡啶甲酸在胞內可以螯合其他金屬離子發(fā)生Fenton反應生成活性氧自由基，并且發(fā)現在磷酸鹽緩沖液中，吡啶甲酸能增強Cr(pic)3的類(lèi)Fenton反應。Stearns(2002)研究發(fā)現：1mM（120倍適宜量）的吡啶甲酸鉻處理組48h后發(fā)現細胞存活率為（68±16）%，而吡啶甲酸組僅為27%；但是發(fā)現該濃度的吡啶甲酸并不存在致突變性。Manygoats(2002)等對CHO細胞研究發(fā)現：吡啶甲酸鉻添加量為1mM時(shí)，48h后發(fā)現37%的細胞發(fā)生凋亡，當量的吡啶甲酸產(chǎn)生的細胞毒性比吡啶甲酸鉻更強，1.5mM（180倍適宜量）的吡啶甲酸處理組的細胞成活率僅有49%，51%的細胞發(fā)生凋亡，71%的線(xiàn)粒體受損。另有研究發(fā)現：3mM濃度的吡啶甲酸24h后發(fā)現線(xiàn)粒體損傷，5－10mM的吡啶甲酸12－24h后細胞發(fā)生凋亡（Ogata等，1998）?？梢?jiàn)在細胞毒性上，吡啶甲酸強于吡啶甲酸鉻。
在微粒體中吡啶甲酸鉻可分解并發(fā)生醯胺化、甲基化反應。將人微粒體與吡啶甲酸鉻共同孵育1h和3h后，分析得出66%的吡啶甲酸鉻被代謝，通過(guò)高壓液相色譜分析兩時(shí)間點(diǎn)的結果沒(méi)有差異。為了驗證結果，采用雞肝細胞體外培養實(shí)驗后發(fā)現，吡啶甲酸鉻全部被代謝，三價(jià)鉻離子脫離。三價(jià)鉻離子的分離可能會(huì )對DNA結構與DNA復制過(guò)程造成負面影響，從而阻止細胞的生長(cháng)增殖，其可能機理如下：Cr（Ⅲ）可與磷酸骨架（Tsapakos等，1983）、鳥(niǎo)嘌呤、染色體組蛋白（H2AX）（Miller等，1989）、染色體結構維持蛋白（SMC）結合（Timothy，2004），從而影響DNA的復制進(jìn)程。還可與DNA復制所需的酶類(lèi)結合，如拓撲異構酶的結合，使DNA松弛活性降低，DNA雙鏈不能完全松弛，導致復制終止；與DNA聚合酶（Tkeshelashvili，1980）、RNA聚合酶（Okada等，1981），翻譯延長(cháng)因子復合體（Wang等，1997）的結合，導致復制、轉錄、翻譯過(guò)程受阻。
DNA內鏈交聯(lián)（ICL）作為DNA加合損傷的另一方式，占DNA-Cr加合物的10%左右，也可阻止DNA的復制。已有研究報道：ICL可以與鳥(niǎo)嘌呤上的N-7殘基（Bauer等，1997），以及與磷酸骨架一定程度的結合，從而物理性地阻止模板DNA的復制（Bridgewater等，1994）。在細胞水平上表現為細胞周期循環(huán)中斷，甚至導致細胞凋亡、程序性死亡。另有資料顯示：Cr-DNA加合物誘導的單堿基的改變通常導致G/C→A/T的轉變與G/C→T/A的顛換，同時(shí)發(fā)現，與鉻螯合的配體差異，可導致堿基替代頻率發(fā)生變化（Quievryn等,2003；Zhitkovich等，2001）。
4、結語(yǔ)
適宜量吡啶甲酸鉻添加對機體代謝有著(zhù)積極作用，當添加量遠高于生理劑量時(shí)有可能產(chǎn)生細胞毒性和DNA毒性。在體內研究吡啶甲酸鉻的安全性上，除靜脈注射途徑外，未見(jiàn)毒性報道。在體外研究上，超量添加吡啶甲酸鉻（>0.6mM）時(shí)可能出現細胞毒性和DNA毒性。其毒性作用與其代謝途徑密切相關(guān)，但作用機理尚不完全清楚，有待于進(jìn)一步研究探索。
